二十一年(1542)，宫婢杨金英等图谋弑君叛逆，世宗靠方皇后营救才得以幸免一死，乃将方皇后的父亲泰和伯方锐进爵为侯。当初，曹妃很有姿色，世宗特别宠爱她，将她册封为端妃。那天晚上，世宗夜宿端妃宫，杨金英等人待世宗睡熟之后，用丝带紧勒世宗的脖子，可是误打死结，世宗没有断气。同伙张金莲知道事情没有办成，便跑去报告方皇后，方皇后迅速赶到，解开丝带，世宗才苏醒过来。事后，方皇后命令内监张佐等人搜捕宫女一同治罪，招出杨金英等人想谋害皇上，王宁嫔为主谋。又说，曹端妃虽然没有参与此事，但也知道这一阴谋。当时世宗受到惊吓，病情严重，不能说话，方皇后传达世宗命令，将端妃、王宁嫔及杨金英等人全部在街市上处以磔刑，还诛杀她们的亲属族人十余人。但是端妃确实不知内情，后来，世宗才知道端妃是被冤枉的。
嘉靖二十六年(1547)十一月十九日，方皇后去世。世宗下诏说：“皇后当时救朕于危急之中，奉天济难，应按元配皇后的礼仪安葬。”将墓地预名为永陵，谥号孝烈，并亲定谥礼的规格，比以往皇后的谥礼更加隆重。礼成，颁诏天下。等到服丧期满，礼臣请求将方皇后的牌位安放在奉先殿东夹室。世宗说道“：奉先殿的夹室不是正位，可以将皇后附祭于太庙。”于是大学士严嵩等请求在太庙东侧设立方皇后的牌位，居于皇母睿皇后之后，皇后寝藏神主则设帐在宪庙皇祖母之右，以按照附祭于祖婆的礼仪原则。世宗说：“附祭之礼至关重要，岂能将就。皇后不是皇帝，而是与皇帝相配者，配祭自然要有一定的次序，哪有享受祭祀依照这样的礼制，而神主的安放却依照那样的礼制呢？方皇后设祭于仁宗庙中，按照新的次序享受附祭，就在朕的位置之后，不要乱了礼制。”严嵩说道：“按新次序附祭，不是臣下所敢言的，况且阴位不同于阳位。”于是世宗下令暂时将方皇后的神主放在睿皇后的旁边。
嘉靖二十九年(1550)十月，世宗终归还是想将方皇后附祭于太庙，命廷臣再议。尚书徐阶认为不能这么做，给事中杨思忠同意徐阶的意见，其余大臣都不说话。皇上从旁得知当时的情形。等到群臣将商议结果上奏，说：“皇后正位中宫，按礼应当享受附祭，但仓促排列庙次，依臣子之情，不只是不敢，确实是不忍心啊。还是设牌位于奉先殿为宜。”世宗十分震怒。徐阶、杨思忠非常惶恐，说“：周朝建有九庙，天子以三昭三穆设庙祭祀祖先。本朝宗庙制度，同堂异室，与《周礼》不同。而今太庙九室都已排满，如果就圣上自己而论，应当附祭于仁宗的庙，固然不用说，但这是他日皇上子孙之事。臣等听说夏人有五庙，商有七庙，周有九庙。礼制由道义而起，五可以为七，七可以为九，九之外也可以再加。所以臣等请求在太庙及奉先殿各增二室，以附祭孝烈皇后，那么可以不必享祭于仁宗之庙，孝烈皇后可以尽快正南面之位，陛下也可以不必有预先设立空位的麻烦了。”世宗听后说道：“身为大臣，觉得该怎么祧庙怎么附祭，你们据理请求就可以了。如果礼制安排正确，又何必去躲避犹豫这么去做呢？”于是徐阶等再次会同廷臣一起上奏道“：唐、虞、夏有五庙，其祭祀都只限于四世。周朝有九庙，为三昭三穆，但它是兄弟相承，祭祀也不能尽满六世。而今仁宗为皇上五世祖，以圣上自己而论，按照礼制应当祧庙于仁宗，孝烈皇后按礼应当附祭。所以臣等请求祧庙于仁宗，附祭孝烈皇后于太庙等九室。”由此呈上祧庙附祭的礼仪条款。
不久，廷臣请求在忌日祭祀，世宗仍对前议耿耿于怀，所以答复说：“孝烈皇后是后立的皇后，她所侍奉的又是外藩入继的皇帝，忌日不祭祀也是可以的。”徐阶等人更加极力请求，世宗说：“不是天子不议礼节。方皇后应当附祭于太庙，排列在朕的庙室之后，礼官对我说今天安排不太合适，这不过是空口说好话以惑众听罢了。”因而对严嵩等人说道：“礼官听从我的话，是很勉强的。既然他们不忍让皇后附祭于仁宗庙里，只有暂且将皇后的神主安放在其他庙室，将来再由大臣们去商议处理吧。皇后的忌日且下令以一杯酒祭奠，也不至于伤了感情。”于是礼臣不再敢言，只是请求按照皇上的命令行事，世宗这才表示同意。两年之后，杨思忠因上贺表时触犯忌讳，被处以杖责和削除官籍的惩罚。隆庆初年，方皇后与孝洁皇后在同一天被上尊谥号为孝烈端顺敏惠恭诚祗天卫圣皇后，方皇后的神主被移至弘孝殿。
孝定李太后是神宗的生母，氵郭县人。她侍奉穆宗于裕邸。隆庆元年(1567)三月，她被封为贵妃，生下神宗。神宗即位，为她上尊号为慈圣皇太后。按照旧制，天子即位，尊皇后为皇太后，若有生母称太后的，则加上徽号以示区别。当时，大监冯保想讨好贵妃，因此以并尊两太后为名，暗示大学士张居正交付廷臣商议，尊皇后为李太后，尊贵妃为慈圣皇太后，皇后与贵妃两人便开始没有区别了。仁圣皇太后住在慈庆宫，慈圣皇太后住在慈宁宫。张居正请求仁圣皇太后看护皇上的起居，乃迁居乾清宫。
李太后管教皇上相当严格。神宗有时不愿读书，李太后便马上将他召来，让他长时间罚跪。每次神宗在经筵听儒臣讲授完毕，李太后总是让神宗在她面前模仿讲臣复述所讲内容。凡到上朝之日，李太后五更时就来到神宗的住处，招呼道“：皇上应该起来了。”下令左右扶皇上起来坐下，取水为他洗脸，然后领着皇上乘车而出。神宗侍奉太后惟命恭谨，而那些奉太后之旨的宦官们，往往对他过分挟持管束。有一次，神宗在西城曲宴上喝多了酒，命内侍唱新曲给他听，内侍推辞说不会，神宗便取剑要杀内侍，幸亏左右加以劝解，才取笑割去内侍的头发。第二天，李太后听说此事，传话给张居正，让他上疏切谏，并令他为皇上起草罪己御札。又将皇上召来罚跪，一一列举他的过错，神宗哭着请求以后改过才算了结。万历六年(1578)，神宗大婚，李太后将返回慈宁宫，她嘱咐张居正道：“我不能再早晚照护皇上了，先生亲受先帝的托付，望每天早晚都能对皇上有所教诲，不负先帝对你的信赖。”三月，加上李太后尊号为宣文。十年加上尊号明肃。十二年，李太后同仁圣太后一起拜谒天寿山陵园。二十九年，再加李太后尊号贞寿端献。三十四年，又加上尊号恭熹。四十二年二月，李太后去世，被上尊谥号为孝定贞纯钦仁端肃弼天祚圣皇太后，合葬于昭陵，另在崇先殿祭祀。
李太后性情严明。万历初年的政务，虽委任张居正，但综核名实，国家近于富强，李太后之功居多。光宗还未被册立为太子时，给事中姜应麟等上疏请求册封太子而被贬谪，李太后听说之后很不以为然。有一天，神宗到慈宁宫陪侍太后，太后便问他不册立太子的原因。神宗回答：“他是都人之子。”太后大怒道“：你也是都人之子。”神宗听后惶恐不已，跪伏在地上不敢起来。原来后宫中叫宫女为“都人”，李太后也是宫女出身，所以她才会这么恼怒。光宗因此才得以立为太子。群臣请求让福王前往藩地，且行程已定，其生母郑贵妃想将出发日期推迟一年，以给李太后祝寿为理由。李太后说道“：我的儿子潞王也可以来京拜寿吗？”郑贵妃听她这么说，才不敢留住福王。御史曹学程因为进言而被判死罪，李太后怜惜他的母亲年老，为他在皇上面前讲情，将他免罪释放。李太后的父亲李伟被封为武清伯。李太后家人曾经犯有过失，她便命宦官前去列举其过，而将有罪家人依法处置。不过太后十分信奉佛教，在京城内外多处建造庙宇，动辄耗费巨万，神宗也出资无数帮助修建。张居正在世时，曾经为此进谏劝阻，但没有被太后采纳。